摘要
随着化学研究的不断深入，液相电镜（LP-TEM）作为原位成像技术在理解化学反应机制和材料合成过程中变得愈发重要。最近，北京大学王欢研究团队设计了一种原位双倾光纤样品杆，整合了激光照明与基于荧光的光谱分析，以开展光联用液相电镜原位实验。该装置实现了光纤位置和载网倾角的在线可调性，使用单光纤完成了激光照明和荧光信号的高效收集，成功获取了常见有机染料（碘化丙啶和花菁类染料）以及FRET对（Cy3/Cy5）的耦合信号，使得LP-TEM实验具备了受控光触发能力，能够在化学反应过程中实时检测荧光小分子，并在LP-TEM中进行大分子的标准FRET实验（FRET-LPTEM）。值得注意的是，该样品杆支持三种流行液池类型，包括碳膜、石墨烯和纳米石英玻璃管液池。基于以上特点，FRET-LPTEM为揭示光学活性有机和生物材料的合成与组装路径提供了新的机遇。
研究背景
近年来，原位成像技术在化学研究中逐渐成为一种重要的工具，尤其是在理解复杂化学反应和材料合成过程中的应用。液相电镜（LP-TEM）作为一种新兴成像技术，能够在液体环境中原位表征样品的微观结构及动态过程，但往往缺乏足够精度的实时化学表征手段。在此背景下，荧光方法作为成熟技术被引入，以提供有效的补充。研究者们开始探索将常见荧光手段如荧光共振能量转移（FRET）与LP-TEM相结合，以实现对化学系统的高效原位成像。这种结合不仅能够提高信号的灵敏度，还能为研究光学活性有机和生物材料的合成与组装路径提供新的视角。
本文亮点
在已报道的关于液相透射电镜研究工作中，王欢研究团队发展了石墨烯液池和纳米石英玻璃管液池在活性高分子与纳米颗粒体系的应用。这些研究基于常规透射电子显微镜，为LP-TEM实验提供了优秀的时空分辨率，但无法与耗时长、模式不同的能谱分析相兼容，导致研究者通常缺乏手段实时获取对象的组分等信息，限制了对化学过程的进一步探索。荧光技术作为一种成熟的、高响应方案有望与LP-TEM联用。于是，王欢研究团队提出了一种可行的样品杆设计，将液池方案与激光照明、荧光信号采集相整合，以测量液相电镜实验中的荧光能量共振转移现象（Förster resonance energy transfer liquid-phase electron microscopy, FRET-LPTEM）。TEM样品杆采用双倾设计，兼容JEM 2100 Plus HC型电镜，极靴处有约10 mm的空间以满足高度要求（～8 mm）。样品杆中心轴嵌入一根多模石英光纤（N.A. = 0.50，芯径400 µm），一端连入外部光学系统，另一端指向载网。光纤与载网的相对位置可由微电机和螺旋微距器控制，可以在电镜观察的同时进行调整。在该设计中，同一根光纤用于激发和收集样品信号，采集设备为连接至光谱仪的电子倍增电荷耦合探测器（EM-CCD，iXon EM+ DU-897，Oxford Instruments），能够支持低至5.25 ms的持续拍摄，与电镜时间分辨率匹配。
荧光信号收集效率受两个参数影响：（1）光纤尖端与EM网格之间的距离；（2）载网的倾斜角度。这些参数可进行调整，以优化检测效率而不干扰TEM采集。控制光谱仪、CMOS相机和激光的软件安装于同一台计算机上，便于调整激光功率、频率调制和光谱仪设置；TEM图像可在同一操作界面上预览。
三种类型的液池均成功应用于光耦合LP-TEM实验：（1）碳膜液池：两个铜载网密封约0.2 μL的有机染料溶液；（2）石墨烯液池：样品溶液被包裹于两片石墨烯薄膜之间；（3）纳米石英玻璃管液池：装载了样品溶液的激光拉制而成的针型石英玻璃管。
为了进一步验证荧光实验的可行性，研究者使用碳膜液池封装了一对花菁类染料（Cy3/Cy5）的混合溶液，采用小于1 s的曝光时间（光漂白可忽略不计），在最佳激发条件下成功记录了荧光共振能量转移现象。其中固定浓度的Cy3（供体）发射峰随着Cy5（受体）浓度增加而衰减，同时Cy5自身发射峰逐渐增加。表观FRET效率Eapp同样支持该结论。值得注意的是，只有在使用液池时才能观察到能量转移现象。即使在电子束打开的情况下，也没有观察到干态染料的发射；这也表明，在液池检测到的光谱中，阴极发光信号的贡献可以忽略不计。
结论
综上所述，FRET-LPTEM技术兼容高极靴透射电子显微镜，能够在LP-TEM实验中同时收集荧光光谱，该设计允许在不干扰TEM成像的情况下实时优化荧光光谱的收集，支持三类常用的液池类型，包括碳膜、石墨烯和纳米玻璃管液池。该技术方案成功实现了从液池中的Cy3/Cy5染料对中获得荧光共振能量转移信号，为化学系统的高精度原位成像提供了新思路。此外，光学系统的灵活可调性保证了该技术的应用广度，其中激光源和光纤可更换，以匹配不同荧光体系的激发光谱。这一研究成果支持同时捕获荧光信号和液相电镜图像，从而提取单分子动态信息，有助于在未来阐明蛋白质相互作用及相关生物物理问题。
文章详情
FRET-LPTEM for In-situ Imaging of Chemical Systems
XU Zhun, ZHANG Deyi, XIONG Tianyu and WANG Huan*
Chem. Res. Chinese Universities, 2025, 41(2)，319-325
https://doi.org/10.1007/s40242-024-4241-7
通讯作者信息
王欢，北京大学化学与分子学院研究员，中国科协青年托举工程入选者，海外优青获得者。2009年获北京师范大学化学学院和励耘班学士学位，2015年获美国亚利桑那大学化学与生物大学系博士学位。随后在韩国基础科学研究院的软物质和生命物质研究中心担任研究员，长聘资深研究员。2021年回国独立建组，研究兴趣是发展多模态成像方法和深度学习图片分析方法解析化学和生化反应瞬时过程和中间态，解析从“单”个反应到“多”个反应的非平衡涌现现象和物理化学规律。以一作和通讯在Science, PNAS，JACS Au, Adv. Mater. ACS Nano, Trends Chem., Anal. Chem. Chem. Commun., J. Phys. Chem. Lett. 等发表论文。
E-mail: wanghuan_ccme@pku.edu.cn
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