《APL》：石墨烯隧穿结用于单分子识别与生物聚合物测序的前景

研究背景

DNA、蛋白质等生物聚合物的单分子测序是生命科学和精准医学中的重要研究方向。传统第一代和第二代测序技术已经实现了较高通量，但在进一步降低测序成本、提高速度以及发展长读长能力方面逐渐面临限制。近年来，以生物纳米孔为代表的第三代测序技术快速发展，通过监测DNA穿过纳米孔时引起的离子电流变化，可以直接获得长链分子的结构与序列信息。

然而，纳米孔的物理尺寸通常大于单个核苷酸。当DNA通过孔道时，多个碱基可能同时影响离子电流，因此原始信号需要复杂的数据解卷积才能完成碱基识别。同时，生物纳米孔本身还存在稳定性和寿命问题。相比之下，如果利用两个纳米电极之间的量子隧穿电流直接读取单个碱基的电子结构，有望进一步提高空间分辨率并实现真正的单分子电学识别。

这种方法被称为识别隧穿（recognition tunneling）。当核苷酸、氨基酸等分析物短暂进入两个纳米电极之间时，会改变电子从一个电极隧穿至另一个电极的概率，由此产生与分子种类相关的电导信号。通过在电极表面引入能够与目标分子形成氢键或其他特异性相互作用的连接分子，还可以限制分析物运动、延长其停留时间，从而提高识别灵敏度和选择性。

目前，金等贵金属电极已经用于核苷酸、氨基酸以及短链核酸的识别隧穿研究，但金属电极本身存在原子结构漂移、化学稳定性不足以及尺寸较厚等问题。尤其是在构建约0.5—2 nm隧穿间隙并进一步将其与纳米孔精确对准时，传统贵金属电极的体积成为重要限制。

针对这些问题，Leiden University的Batuhan S. Can、Norman V. V. Blümel、Erik P. van Geest、Max Makurat、Jan M. van Ruitenbeek和Grégory F. Schneider等在 Applied Physics Letters 发表展望文章，系统讨论了以石墨烯边缘替代贵金属电极构筑识别隧穿结的潜力，并提出实现单分子识别和长读长生物聚合物测序所需解决的关键技术问题。

研究内容

识别隧穿的基本结构由两个导电电极组成，中间形成亚纳米至纳米尺度的间隙。在施加偏压后，虽然两个电极之间不存在经典意义上的直接导电通路，但电子仍可通过量子隧穿跨越势垒。

当目标分子进入隧穿间隙后，其原子和分子轨道会改变局域势能分布，同时与电极电子态发生耦合，从而产生新的电子输运路径。因此，隧穿电流不仅与电极间距有关，还受到分析物的空间位置、取向、构象以及电极—分子相互作用的影响。

在液体环境中，分析物会发生旋转、摆动和翻转，并不断形成和断裂与电极之间的瞬态相互作用，因此单个分子的隧穿电导不是固定数值，而是形成一定的统计分布。若能通过空间限制、电场作用或分子间相互作用约束分析物运动，就可以减小电导峰宽度，使不同分子对应的电导分布更加容易区分。作者指出，空间位阻、电场以及氢键、范德华作用等分子间相互作用，是限制分析物自由度的三类主要因素。

识别隧穿正是利用这一原理，在电极表面引入特定连接分子，与经过间隙的核苷酸形成短暂而可重复的相互作用。相比完全依赖随机进入间隙的普通隧穿检测，该策略能够增加分子停留时间，减少构象波动，进而缩小不同分析物的电导分布并提高识别准确率。

图1 不同电子隧穿核苷酸检测方式。（a）机械可控断裂结（MCBJ）；（b）扫描隧道显微镜（STM）形成的纳米间隙；（c）石墨烯隧穿结，其边缘可以通过连接分子进行化学功能化，从而实现核苷酸的识别隧穿。

与贵金属相比，石墨烯具有明显的结构优势。首先，石墨烯由稳定的碳—碳网络构成，具有较高的机械和化学稳定性，不容易出现金电极常见的原子结构漂移。其次，石墨烯仅有一个原子层厚，其基面与边缘具有明显不同的电荷输运特征。在液相条件下，电子隧穿路径有望主要集中于一维石墨烯边缘，从而显著减小有效传感区域，提高空间分辨率。

更重要的是，石墨烯边缘可以进行化学修饰，在局域位置引入用于识别分析物的功能基团。理论模拟已经表明，石墨烯边缘组成、电极—基底相互作用、电场以及液体环境都会影响隧穿信号，并且原则上可以利用这些差异区分不同核苷酸甚至氨基酸。

不过，从概念验证走向真正的石墨烯单分子测序器件，作者认为仍需解决五个关键问题。

首先是在液体环境中构筑稳定且可重复的石墨烯隧穿结。石墨烯自身虽然非常稳定，但在器件加工以及水溶液环境下可能发生损伤或从基底脱层，特别是水分子进入石墨烯—基底界面后，会削弱二者之间的黏附。因此，需要增强石墨烯与绝缘基底之间的作用，例如通过芘类分子层引入π—π相互作用，以提高液相器件稳定性。

第二个问题是精准控制石墨烯边缘的化学性质。识别隧穿需要在边缘引入特定结合位点，以降低核苷酸在间隙中的构象自由度。理论研究表明，氮功能化石墨烯边缘相较氢终止边缘可能产生更高的核苷酸隧穿电流。作者特别提出，可利用芳基重氮盐的电化学接枝实现功能化，并通过设计不同连接基团引入氢键等选择性相互作用。

第三个关键问题是确认功能分子是否真正修饰在石墨烯边缘。石墨烯具有扶手椅型和锯齿型等不同边缘构型，其反应活性可能不同，因此不仅需要控制修饰过程，还需要在纳米尺度确认边缘的化学组成和功能分子的空间位置。作者提出，表面增强拉曼光谱和针尖增强拉曼光谱可能成为重要表征工具。

第四个问题，也是实现长读长测序的核心，是将石墨烯隧穿结集成到纳米孔中。如果仅让DNA随机经过两个电极之间，分子可能折叠或者从敏感区域旁边经过，无法保证每个碱基逐一进入检测区域。因此，需要利用纳米孔对生物聚合物进行空间限制和导向。

作者提出了一种界面纳米孔方案：首先在两块聚合物薄片中分别嵌入相互垂直的金纳米结构，将两块薄片叠合后刻蚀掉金，即可在交叉区域形成纳米孔。随后在两层之间加入石墨烯，并对石墨烯进行刻蚀，可形成直接与纳米孔对准的多个石墨烯电极。与需要分别加工纳米孔和纳米电极再进行亚纳米级对准的传统方案相比，这种结构具有更好的集成潜力。

图2 石墨烯隧穿结与纳米孔的集成方案。（a）通过在聚合物薄片中嵌入金纳米结构并进行交叉堆叠、刻蚀，形成界面纳米孔；（b）所制备纳米孔的AFM图像；（c）在两层结构之间加入石墨烯并刻蚀形成多个纳米间隔电极；（d）识别隧穿示意图，相对的石墨烯边缘通过功能分子修饰，与穿过纳米孔的DNA核苷酸形成瞬态相互作用。

最后一个问题是控制生物聚合物通过传感区域的速度。DNA移动过快时，单个碱基停留时间不足，电子学系统无法采集足够数据进行可靠识别。作者根据约100 pS的核苷酸特征隧穿电导和10 kHz放大器带宽估算，理想情况下的最大运动速度约为3个碱基/ms，才能保证每个碱基拥有足够的信号采集时间。

与传统纳米孔离子电流测序相比，隧穿电流检测在这一问题上具有一个潜在优势：驱动DNA运动的离子电流和用于读取核苷酸的隧穿电流彼此独立。因此，可以降低驱动电压，同时通过降低温度、调节电解质浓度、建立盐浓度梯度、增加溶液黏度、使用分子马达以及加强DNA与孔壁之间的相互作用等方式进一步减慢DNA运动。

总结概述

本文从单分子识别和生物聚合物测序的角度，系统讨论了石墨烯边缘隧穿结相较传统贵金属电极的潜在优势。石墨烯具有原子级厚度、较高机械和化学稳定性，其电子隧穿敏感区域可以集中于一维边缘，因此在理论上能够提供更高的空间分辨率。

与此同时，石墨烯边缘具有可化学修饰的特点，可以引入特异性连接基团，通过识别隧穿限制目标分子的空间运动，从而提高检测灵敏度和分子识别能力。若进一步将石墨烯隧穿电极与纳米孔结合，就有望对DNA等长链生物聚合物进行连续导向，并逐个读取其组成单元。

不过，真正实现这一目标仍需要解决液相器件稳定性、边缘精准功能化及表征、纳米孔—隧穿结集成、器件规模化制备以及生物聚合物运动速度控制等问题。作者认为，这些关键节点一旦得到突破，石墨烯识别隧穿不仅有望应用于DNA长读长测序，也可能进一步拓展至肽、蛋白质和糖类等其他生物聚合物的单分子识别。

文章作者

本文作者为Batuhan S. Can、Norman V. V. Blümel、Erik P. van Geest、Max Makurat、Jan M. van Ruitenbeek和Grégory F. Schneider，来自荷兰Leiden University化学研究所和物理研究所。Batuhan S. Can和Norman V. V. Blümel为共同第一作者，通讯作者为Grégory F. Schneider。

原文信息

文章题目：A Perspective on graphene junctions for recognition tunneling

中文译题：石墨烯结用于识别隧穿的研究展望

期刊：Applied Physics Letters

文章类型：Perspective（展望文章）

投稿日期：2024年2月12日

接收日期：2024年5月4日

在线发表日期：2024年5月20日

卷期信息：Appl. Phys. Lett. 124, 210501 (2024)

DOI：10.1063/5.0203315