山东大学韩琳教授、韩云蕊副教授课题组ES&T：氧化石墨烯赋能RPA：构建有害藻类高灵敏快速检测新方法

图文摘要

成果简介

近日，山东大学韩琳教授团队在Environmental Science & Technology上发表了题为“Recombinase polymerase amplification coupled with graphene oxide nanomaterial-assisted purification and target signal selection for highly sensitive and rapid harmful algae detection”的研究论文(DOI: 10.1021/acs.est.6c07778)，提出了一种氧化石墨烯（GO）与Mg²⁺协同调控的重组酶聚合酶扩增检测新策略（G-M-RPA）。该方法将核酸恒温扩增、氧化石墨烯纳米材料辅助纯化及靶标荧光信号选择相结合，通过GO包覆磁性纳米复合材料实现扩增产物的快速纯化，并利用GO与Mg²⁺协同调控荧光标记引物的吸附和淬灭行为，有效降低非特异性荧光背景，提高检测灵敏度。该方法可在约30 min内完成有害藻类检测，基因组DNA检测限低至3.3 fg/μL，对应赤潮异弯藻约7 cells/mL。研究同时验证了该方法在混合DNA和海水基质中的检测性能，展现出良好的特异性、重复性及抗基质干扰能力。该成果为复杂海洋环境中有害藻类的快速分子检测提供了新思路，也为未来构建集成化、便携式海洋生物监测系统奠定了技术基础。

全文速览

针对传统有害藻类分子检测依赖精密仪器、样品处理繁琐及荧光背景干扰等问题，本研究提出了一种氧化石墨烯（GO）与Mg²⁺协同调控的重组酶聚合酶扩增检测策略（G-M-RPA），构建了集核酸恒温扩增、纳米材料辅助纯化与靶标荧光信号选择于一体的快速检测体系。该方法利用GO包覆磁性纳米复合材料快速去除扩增后的蛋白等干扰组分，将纯化时间由15 min缩短至2 min；进一步通过GO与Mg²⁺协同调控残余荧光标记引物的吸附与淬灭，有效降低非特异性背景信号，提高检测灵敏度。研究实现了对赤潮异弯藻、微小原甲藻和血红赤潮藻三种典型有害藻类的快速检测，总检测时间约30 min，基因组DNA检测限低至3.3 fg/μL，并在混合DNA及海水基质中表现出良好的检测性能。该成果为复杂海洋环境下有害藻类的高灵敏快速检测提供了新方法，也为未来集成化、便携式现场监测设备的研发奠定了技术基础。

引言

传统有害藻类分子检测方法存在设备依赖性强、检测流程繁琐等问题，而恒温核酸扩增技术仍面临扩增后杂质干扰、非特异性荧光背景较高等挑战，限制了其在复杂海洋环境中的快速检测应用。本工作将重组酶聚合酶扩增（RPA）与氧化石墨烯（GO）纳米材料辅助纯化及Mg²⁺协同荧光信号调控相结合，通过扩增后快速去除蛋白等干扰组分并选择性淬灭残余荧光标记引物，实现了有害藻类的高灵敏快速检测。

图文导读

• 检测原理

本研究构建了氧化石墨烯与Mg²⁺协同调控的G-M-RPA荧光检测体系。首先通过RPA实现靶标核酸的快速恒温扩增，随后利用GO包覆磁性纳米复合材料去除扩增体系中的蛋白等干扰组分，最后通过GO与Mg²⁺协同调控残余荧光标记引物的吸附与淬灭，实现非特异性背景抑制和靶标荧光信号的有效识别。

• 方法验证

通过核酸扩增与荧光检测实验，验证G-M-RPA检测策略的可行性。结果表明，RPA能够快速实现靶标DNA扩增，GO对残余荧光标记引物具有显著的荧光淬灭作用。与常规扩增检测方式相比，G-M-RPA能够有效降低阴性背景信号，提高阳性与阴性样品的荧光区分度，验证了纳米材料辅助纯化与信号选择策略的有效性。

• 条件优化

为提高检测体系的灵敏度和稳定性，系统优化了RPA反应温度、扩增时间以及GO和Mg²⁺的作用条件。实验确定41℃和10 min为适宜的RPA扩增条件，并通过调节GO与Mg²⁺的浓度，优化残余荧光引物的吸附与淬灭效果，提高阳性样品与阴性对照之间的荧光信号差异，为后续高灵敏检测奠定基础。

• 性能评价

通过不同浓度靶标DNA的荧光响应，系统评价G-M-RPA的检测灵敏度、特异性、重复性及稳定性。结果表明，该方法对赤潮异弯藻基因组DNA的检测限低至3.3 fg/μL，约相当于7 cells/mL。针对近缘藻种及其他非靶标有害藻类的交叉反应实验显示出良好的检测特异性，同时具有较好的信号重复性与短期稳定性。

• 海水验证

为评价G-M-RPA在复杂海洋环境中的应用潜力，研究开展了海水基质加标回收及模拟样品检测实验。结果表明，该方法在海水基质中仍能有效识别不同浓度的靶标DNA，加标回收率为91.8%—109.2%。阳性样品与阴性对照之间具有显著的荧光信号差异，说明该体系具有良好的基质适应性，为未来有害藻类现场快速检测提供了实验依据。

小结

本研究针对传统有害藻类分子检测流程繁琐、非特异性荧光背景干扰等问题，创新性地提出了氧化石墨烯（GO）与Mg²⁺协同调控的G-M-RPA快速检测策略。通过将RPA恒温扩增、GO包覆磁性纳米复合材料辅助纯化及靶标荧光信号选择相结合，实现了扩增后干扰组分的快速去除与背景荧光的有效抑制。该方法可在约30 min内完成检测，基因组DNA检测限低至3.3 fg/μL，并在复杂海水基质中展现出良好的检测性能。该研究为有害藻类高灵敏快速检测提供了新方法，也为功能纳米材料与核酸扩增技术的深度融合提供了新思路。未来，通过进一步集成微流控芯片与便携式荧光检测设备，有望推动该技术向现场自动化检测及海洋生态环境实时监测方向发展。

作者介绍

第一作者/通讯作者：韩云蕊 副教授（山东大学）

樊广鹏在实验过程中做了重要贡献，韩琳教授在工作中给予了重要指导。

韩云蕊：山东大学副教授、硕士生导师，青岛市科技库入库专家，山东大学青年学者未来计划获得者，斯坦德科创集团特聘专家。主要从事微纳传感检测生物芯片及便携式检测设备研发，用于环境微生物及环境污染物的快速高灵敏检测。以第一作者或者通讯作者身份在Environmental Science & Technology, Journal of Colloid and Interface Science，ACS Appl. Mater. Interfaces等期刊上发表SCI论文20余篇，申请或授权发明专利8项，登记软件著作权1项，参编教材1项。主持国家自然基金、国家重点研发计划子课题、山东省自然科学基金、广东省基础与应用基础研究基金、中国博士后科学基金、青岛市自然科学基金等10余项科研项目。曾获第十一届国际发明展览会金奖、第三十届全国发明展览会银奖等荣誉。

韩琳：山东大学教授，博士生导师，万人领军人才，泰山学者特聘专家，山东大学杰出中青年学者，齐鲁青年学者，山东省杰出青年基金获得者，山东大学青年交叉科学创新群体首席，山东大学海洋研究院微纳传感检测芯片与系统团队PI。主要研究方向：聚焦新型半导体材料、器件及其光/电传感机制，集成微纳加工技术，面向生命健康和海洋环境监测，研发新型生物传感芯片与系统，形成了10余种国际先进水平的生物芯片，在齐鲁医院、北京大学第三医院等多家医院进行了~10000例临床样本的验证，获批4个二类医疗器械注册证。近年来，以第一或通讯作者在 Chemical Society Review、Advanced Materials、Advanced Functional Materials、ACS Nano等国际知名期刊发表学术论文100余篇，授权专利70余项，实现了1000万元的技术成果转化，相关成果被中央人民广播电台特别报道。主持国家重点研发计划（课题2项，子课题1项）、国家自然基金青年/面上、山东省杰出青年基金、山东省重大创新工程项目课题等10余项，担任山东大学青年交叉科学群体项目首席。获山东省技术发明一等奖（第一位）、山东省科技进步二等奖（第三位）、国际发明展览会金奖（第一位）、山东省优秀研究生导师、山东大学“三八红旗手”等奖励。担任国家高起点卓越期刊BMEMat（卓越期刊，IF：15.5）执行副主编、山东省医学会类器官分会第一届委员会副主任委员、生物标志物与人工智能应用山东省工程研究中心副主任和济南市微纳传感芯片与智能装备重点实验室主任。入职山东大学以来，指导硕、博士研究生~40人，其中获得山东省优秀成果奖6人次、山东省优秀硕、博士论文4人次、国家奖学金、校长奖学金等其他荣誉50多人次。