意大利理工学院Fabio Benfenati–氧化石墨烯和少层石墨烯与血脑屏障的相互作用

我们采用了两种复杂性不断增加的体外BBB模型来研究与氧化石墨烯(GO)和几层石墨烯(FLG)的仿生相互作用:二维小鼠Transwell模型,然后是三维人类多细胞集合体,以模仿体内结构的复杂性和细胞间的串扰。我们开发了特定的方法来评估GO和FLG在无标签方式下的转移,以及一个适用于任何纳米材料的平台。

由于石墨烯基材料(GRMs)的生物相容性和高运载能力,它可能代表了一种理想的大脑输送系统。石墨烯基材料到达大脑的能力主要是在体内进行的调查,并突出了一些争议。在此,我们采用了两种复杂性不断增加的体外BBB模型来研究与氧化石墨烯(GO)和几层石墨烯(FLG)的仿生相互作用:二维小鼠Transwell模型,然后是三维人类多细胞集合体,以模仿体内结构的复杂性和细胞间的串扰。我们开发了特定的方法来评估GO和FLG在无标签方式下的转移,以及一个适用于任何纳米材料的平台。总的来说,我们的结果显示这两种GRM具有良好的生物相容性,不影响屏障的完整性和功能。充分分散的GO和FLG亚群被内皮细胞积极吸收;然而,这种转移被认为是一种罕见的事件。

意大利理工学院Fabio Benfenati--氧化石墨烯和少层石墨烯与血脑屏障的相互作用

图1. 接触GRM后BBB特性的描述。暴露于10μg/mL的GO(A)或FLG(B)48小时后,在玻璃盖玻片上播种的bEnd.3单层细胞中,ZO-1(绿色)的免疫荧光染色的代表性共聚焦图像。Hoechst染料用于核子的可视化(蓝色)。GRM颗粒在光反射模式(LR)模式下是可见的(粉红色)。BF表示亮场图像。比例尺。50μm。(C)暴露于10μg/mL的GO和FLG 6、24和48小时后的TEER值。对于每个时间点,其值都被归一化,并以平均值±SD表示(n=9个独立的制备)。(D)暴露于10μg/mL的GO和FLG 6和48小时后,FD4的表观渗透性(Papp,%)。没有细胞的Transwell(空)的Papp表示为100%,数值相应地被归一化。数值表示为平均值±SEM(n = 3)。

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图2. GO和FLG的摄取动力学和内化途径。代表性的TEM显微照片显示GO(A)和FLG(B)薄片在bEnd.3细胞中的细胞内化。在左边的低倍显微镜照片中,N表示细胞核。(C) GO和FLG(10 μg/mL)在bEnd.3细胞单层中暴露于这些材料2、6、24和48小时的吸收动力学。数据表示为平均值±SEM(n = 3个独立制备)。*p < 0.05, ***p < 0.001, 非配对学生t检验。在没有或存在不同的内吞作用抑制剂(CPZ、CYTD、NOC)的情况下,暴露2小时后细胞对GO(D)和FLG(E)(10 μg/mL)的吸收。平均数±SEM,n = 3。** p < 0.01, ***p < 0.001, 单向方差分析/Tukey检验。所有摄取量的测量是由SSC在流式细胞仪中完成的,并在未处理的细胞(CTRL)上进行归一化处理。

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图3. GO和FLG在bEnd.3细胞单层上的转位。(A) 两种GRM片穿过二维BBB模型的过程示意图。(B)用10μg/mL的GO或FLG培养24小时的bEnd.3细胞的代表性共聚焦XY平面和Z投影。细胞用Hoechst(细胞核,蓝色)和ZO-1抗体(绿色)进行染色。比例尺。50μm。(C)去除细胞后的Transwell膜(BF)的代表Z投影图。一些GO和FLG的片状物在膜上易位,可见粉红色(LR模式)。比例尺:20μm。(D)基底层馏分的分析:基底层馏分中发现的石墨烯团块的代表性拉曼光谱和相应的样品区(插图中的BF图像)。

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图4. 与线性弯曲、Hencky解和FvK模型相比,GPH膜相对于径向位置的偏转。(a) 254 nm的膜厚加压至ΔP=21 kPa。(b) 夹紧膜边缘周围(a)的放大。(c) 65 nm的厚度加压至ΔP=68 kPa。(d) 夹紧膜边缘周围(b)的放大。(e) 加压至ΔP=116 kPa的45 nm厚度。(f) 夹紧膜边缘周围(e)的放大。

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图5. GO和FLG与BBB的三维人类多细胞集合体模型的相互作用:流式细胞仪和TEM分析。(A) 预染hMCA形成和解离的工作流程示意图。(B) NHA、hBPV和hCMEC/D3的三个独立培养物在流式细胞仪上一起运行时,SSC与FSC(前向散射)的点图和细胞追踪器红色(星形胶质细胞)和绿色(周细胞)的门控。(C) 解离的hMCA的SSC与FSC和细胞追踪器红色(星形胶质细胞)和绿色(周细胞)的点阵图。(D) 在流式细胞仪上独立运行的三种细胞类型(NHA、hBPV和hCMEC/D3)的平均SSC定量。(E) 三个细胞型(NHA、hBPV和hCMEC/D3)在hMCA解离后的平均SSC定量。数据表示为平均值±SEM(n = 2)。(F) 不同细胞型对GO和FLG的吸收,以SSC的倍数比对照细胞增加表示。数据表示为平均值±SEM(n = 3)。暴露于GO(G)和FLG(H)的hMCA的TEM显微照片,显示了周边细胞层的罕见材料内化。

相关研究成果由意大利理工学院Valentina Castagnola和Fabio Benfenati  等人2023年发表在Nano Letters (https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c00377)上。原文:Interactions of Graphene Oxide and Few-Layer Graphene with the Blood–Brain Barrier。

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