【纳米】华中农大韩鹤友教授团队Angew：石墨烯纳米载体用于植物基因沉默研究取得进展

RNA干扰（RNAi）技术的发展为研究植物基因功能、信号通路和作物育种等领域提供了有力的工具。目前小干扰RNA（siRNA）在完整植物细胞中的递送一般依赖于农杆菌转化法和病毒递送手段，但这些递送方式通常会产生随机的基因组整合，导致siRNA的不可控表达，从而难以精准控制基因沉默周期。同时，由于完整植物细胞致密坚韧而又多层的细胞壁阻碍了大尺寸物质的细胞内转运，导致外源生物分子难以被传统方法以外的手段有效递送。因而需要发展新型递送手段来实现高效、瞬时的基因沉默。

图1. GONs-siRNA在完整植物细胞中基因沉默的示意图

针对这些问题，华中农业大学韩鹤友教授课题组将RNAi与纳米技术相结合，设计开发了一种氧化石墨烯纳米颗粒介导的siRNA递送系统，在无外力作用下实现在完整植物细胞中高效、瞬时的基因沉默。此前尚未有概念认为氧化石墨烯可以作为生物分子的递送载体用于植物系统，这主要是由于未经处理的氧化石墨烯为微米级的大尺寸二维结构，难以在植物组织内传递并穿透细胞壁内化。韩鹤友教授团队采用功能性高分子修饰、机械破碎分离的技术手段，制备出100 nm左右的氧化石墨烯纳米颗粒（GONs）。如图1所示，研究发现GONs能够高效搭载siRNA并进一步缩小为20-30 nm左右的小尺寸球状纳米复合物（GONs-siRNA），同时该GONs载体具有使用简单、稳定性好、保护siRNA等优点。

图2. GONs-siRNA的表征

该团队使用了一种转基因烟草（N. benthamiana 16C），其能够在细胞质稳定表达内源绿色荧光蛋白（GFP）。如图3所示，在激光共聚焦显微镜（CLSM）的观察下，GONs-siRNA能够将Cy3标记的siRNA有效递送进烟草细胞质内。通过透射电子显微镜（TEM）与CLSM观察，GONs-siRNA展现出与植物细胞壁强烈的亲和，大部分颗粒附着于细胞壁表面，部分GONs-siRNA直接跨越细胞壁内化进植物细胞。

图3. GONs递送siRNA进入植物细胞

如图4所示，该团队使用该方式递送靶向内源性GFP的siRNA，在24 h实现了mRNA水平97%左右的高效基因沉默，同时在48 h出现蛋白表达的显著下降。重要的是，GONs介导的基因沉默具有明显的瞬时性，靶标mRNA在 72 h恢复到正常水平的66%左右，在120 h完全恢复到正常水平。靶标基因的蛋白表达也在72 h后开始恢复，120 h完全恢复到正常水平。同样的，对烟草内源基因NbPDS与NbSGS3的基因沉默也产生明显的抑制与快速恢复。值得一提的是，这种GONs载体具有良好的生物相容性，在整个研究过程中未发现对植物细胞的损伤。

图4. GONs-siRNA在植物中产生基因沉默

该成果首次证明了氧化石墨烯能够作为siRNA递送载体应用于植物系统。这种瞬时高效的新策略将促进纳米材料作为植物基因工程工具的应用。这一成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition 上，本文的第一作者为生命科学技术学院博士研究生李烁钧，通讯作者为韩鹤友教授。该研究得到了“国家自然科学基金”（21778020, 21807036）等项目的资助。

原文：

Efficient Gene Silencing in Intact Plant Cells Using siRNA Delivered By Functional Graphene Oxide Nanoparticles

Shuojun Li, Jiaying Li, Moqing Du, Guiyun Deng, Zhiyong Song, Heyou Han

Angew. Chem. Int. Ed., 2022, DOI: 10.1002/anie.202210014

韩鹤友教授

韩鹤友，博士，教授，博士生导师，华中农业大学研究生院常务副院长，农业微生物学国家重点实验室固定研究人员，华中农业大学化学生物学研究所所长，生物质与生物能源研究中心副主任，湖北省化学化工学会常务理事，农业部食品安全评价重点开放实验室副主任，教育部“新世纪优秀人才支持计划”获得者，武汉市学科带头人，湖北省创新团队带头人，美国化学会会员，《American Journal of Biomedical Sciences》、《分析科学学报》、《光散射学报》、《华中农业大学学报（自然科学版）》等杂志编委，享受国务院特殊津贴。

主要研究方向为农业纳米生物技术、食品安全分析等。主持包括国家自然科学基金在内的省部级以上科研课题10余项。2006年至2016年7月，以第一作者或通讯作者在Advanced Materials、Nature Communications、ACS Nano、Science Advances 、Advanced Functional Materials 、Analytical Chemistry、Chemical Communications、Nanoscale、Biosensor and Bioelectronics 等国内外重要期刊发表学术论文百余篇，其中影响因子大于5.0的近30篇，论文总被引用次数为1747次，个人H指数达24，授权专利11项，科研鉴定成果2项。

课题组网站

http://hyhan.hzau.edu.cn/member/prof_heyou_han.html

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：如上所述，由于植物细胞不同于动物细胞，其存在刚性多层的细胞壁结构，阻碍了生物大分子向细胞内转运。在植物系统中的基因递送目前严重依赖于农杆菌侵染，基因枪，病毒介导等形式，目前这些传统递送方式已经限制了植物基因工程的进一步发展。从动物系统中纳米载体介导生物大分子递送的进展中得到启发，纳米材料介导的植物基因递送很可能是即将到来的技术性革命。到目前为止，大多数关于纳米材料与植物系统的研究主要集中在植物介导金属纳米粒子的生物合成，农药传递和植物体对纳米材料的吸收，展现出对植物生长有利或有害的影响。而纳米材料作为载体搭载外源生物分子在植物中实现递送或表达的研究相对来说有限。我们先前已经研究了利用碳纳米管作为植物基因递送载体并取得了一些进展，积累了有关植物递送的经验。虽然此前尚未有报道石墨烯能够作为生物分子的递送载体应用与植物，但在我们的其它工作中，已经发掘了石墨烯具有递送外源基因的潜力。因此基于我们团队前期的研究基础与技术积累，我们设计开发了这一基于氧化石墨烯的RNAi递送系统。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：未经处理的氧化石墨烯尺寸过大难以有效递送进植物组织内，因而石墨烯载体的尺寸缩小是实现递送目标的技术关键。由于团队有过剥离单壁碳纳米管的经验，经过尝试后我们克服了这一难题。另外值得一提的是，由于烟草是异源四倍体，其遗传背景的复杂性导致了在设计一些内源靶标上比起其它植物要复杂。

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助？

A：如上所述，这一纳米载体作为基因递送工具，由于不存在农杆菌那样的物种选择性，可以广泛应用于多种植物的基因工程研究中。这一工具的一个较大优势是瞬时性的基因沉默，未来可以服务于基因功能、信号通路和基因编辑等研究中，如在当前火热的植物基因组编辑研究中，通过在窗口期内精准抑制非同源末端连接(NHEJ)修复途径相关基因的表达来提高植物的同源重组效率修复（HDR）效率。同时，除了递送siRNA外，递送外源DNA，mRNA或蛋白等多水平递送都是有可能实现的。另外值得一提的是，在我们早期的研究中，已经发现氧化石墨烯具有抗植物病原体的功能，因而与RNAi技术协同用于植物病害的研究也是可能的，我们目前已经在开展针对柑橘黄龙病的应用研究，敬请期待我们的后续工作。